Metoda Maxama-Gilberta

Metoda Maxama-Gilberta – metoda sekwencjonowania DNA wykorzystująca specyficzną, chemiczną degradację DNA.

Autorami metody byli Allan Maxam i Walter Gilbert. Gilbert otrzymał w roku 1980 za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii (wraz z Frederickiem Sangerem, który w tym samym czasie opracował odmienną metodę sekwencjonowania DNA, znaną obecnie jako metoda Sangera[1]). Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.

Zasada metody

Metoda Maxama-Gilberta opiera się na wyznakowaniu cząsteczek DNA na końcu 5' radioaktywnym izotopem fosforu 32P, a następnie ich degradacji w czterech odrębnych reakcjach, wykorzystujących odmienne zestawy związków chemicznych (przedstawione w tabeli poniżej). W pierwszym etapie procesu następuje modyfikacja specyficznych dla danego reagentu zasad azotowych nukleotydów. W wyniku modyfikacji możliwe jest ich selektywne oderwanie od reszt cukrowych. W miejscach pozbawionych zasad (ang. abasic site) nić DNA ulega pęknięciu (miejsce cięcia znajduje się za zmodyfikowanym nukleotydem).

Miejsce cięcia Związki chemiczne
G siarczan dimetylu + piperydyna
G + A siarczan dimetylu + piperydyna + kwas mrówkowy
C hydrazyna/chlorek sodu + piperydyna
C + T hydrazyna + piperydyna

Warunki reakcji dobrane są w ten sposób, aby jedna nić DNA uległa przecięciu na 2–3 fragmenty, z których jeden zawiera znacznik izotopowy. Ponieważ dana zasada występuje w łańcuchu DNA wielokrotnie, w mieszaninie poreakcyjnej znajduje się zbiór wielu fragmentów DNA o różnej długości, zależnej od miejsca cięcia. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji rozdziela się elektroforetycznie, po czym poddaje autoradiografii uwidaczniającej łańcuchy DNA wyznakowane izotopowo. Uzyskane prążki odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 3' określoną zasadę.

Przypisy

  1. ↑ The Nobel Prize in Chemistry 1980: Paul Berg, Walter Gilbert, Frederick Sanger. nobelprize.org. [dostęp 2011-04-08]. (ang.).

Bibliografia

  • Maxam AM, Gilbert W. A new method for sequencing DNA. „Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.”. 74 (2), s. 560–564, 1977. DOI: 10.1073/pnas.74.2.560. PMID: 265521. 
  • Cecilia Saccone, Graziano Pesole: Handbook of comparative genomics: principles and methodology. New York: Wiley-Liss, 2003, s. 133. ISBN 0-471-39128-X.
  • Sekwencjonowanie - są już do tego maszyny. Biologia Molekularna w Internecie (strona archiwalna), 2006. [dostęp 2011-04-08]. (pol.).